關鍵詞： 靜態流動模式、BSA蛋白、分子量分布、凝膠滲透色譜、光散射、SEC-RI

引言：
BeNano 納米粒度及 Zeta 電位分析儀的靜態流動模式，是專為與凝膠滲透色譜（GPC/SEC）系統聯用而設計的高效檢測方案。該模式結合 GPC/SEC 強大的組分分離能力與光散射的絕對分子量測定優勢，為蛋白質等生物大分子的精細表征提供了有力工具。本應用報告展示了該模式在分析牛血清白蛋白（BSA）分子量及其分布狀態方面的出色表現。

核心原理與設備配置：

1. 前端分離： 實驗中采用市場主流品牌的凝膠色譜系統（SEC/GPC），配備示差折光檢測器（RI），使用 TSK 氧化硅色譜柱對樣品進行精確分離。SEC 依據分子尺寸差異，將樣品中的不同組分依次分離洗脫。

2. 核心檢測： 使用丹東百特 BeNano 180 Zeta Max 分析儀（配置靜態流動模式模塊）。儀器核心光源為 671 nm、50 mW 的激光器，在 90° 角度精確收集樣品的靜態光散射（SLS）信號。

3. 信號聯動： 采用 BFC-1 信號采集器，同步接收并整合來自前端 SEC 系統的示差折光檢測器（RI）輸出的模擬信號。

4. 流通池： 測試選用 27μL 低容量流通池，確保高靈敏度和低擴散。

5. 理論基礎： BeNano 采用單角度靜態光散射技術。根據瑞利散射理論，只要被測分子尺寸不超過入射光波長的 1/40，即可保證分子量測定結果的準確性，這一特性使其特別適用于蛋白質類樣品的檢測。

樣品制備與測試條件：

• 樣品：牛血清白蛋白（BSA）。

• 溶劑：pH = 7 的 PBS 緩沖液。

• 濃度：5 mg/mL。

• 進樣量：100 μL。

• 流速：0.7 mL/min。

• 溫度：BeNano 檢測池溫度嚴格控制在 25°C，與室溫環境保持一致。

• 流程：樣品溶液經 SEC 系統進樣并完成色譜柱分離后，分離的組分按分子大小順序依次流經 RI 檢測器和 BeNano 的流通池，同步采集 RI 信號和 SLS 信號。

實驗結果與深入分析：

1. 流出峰圖： BSA 樣品經色譜柱分離后，洗脫曲線呈現多個明顯的流出峰。這一現象清晰表明，在測試條件下，BSA 在 PBS 緩沖液中并非單一狀態，而是存在不同尺寸的聚集體。

2. 分子量計算： 通過對 RI 信號和光散射信號進行基線校正和峰積分處理，精確計算出每個洗脫峰對應的重均分子量（Mw），結果匯總于表 1。

3. 分子量分布曲線： 對整體信號進行積分處理，繪制出分子量隨洗脫體積變化的分布曲線。該曲線清晰顯示：隨著洗脫體積增加（即流出時間延長），分子量呈現規律性下降。這完全符合凝膠色譜“大分子先流出，小分子后流出”的基本分離原理。值得注意的是，在每個獨立的洗脫峰內部，分子量均保持相對穩定的平臺狀態，這與蛋白質在特定寡聚狀態下分子量分布高度均一的特性高度吻合。

4. 聚集體判定：

• 峰1（最后流出的峰）的 Mw 測定值約為 66K，與 BSA 單體的理論分子量精確吻合。

• 峰2、峰3、峰4 的 Mw 測定值分別約為峰1的 2 倍、3 倍和 4 倍。

• 據此可明確判斷：峰2代表BSA二聚體，峰3代表三聚體，峰4代表四聚體。

結論：

本應用報告成功利用丹東百特 BeNano 180 Zeta Max 的靜態流動模式，實現了對 BSA 蛋白樣品的分子量及其分布狀態的精確表征。實驗結果充分證明：

• BeNano 靜態流動模式能夠與 SEC/RI 系統無縫聯用，準確測定洗脫液中各分離組分的絕對分子量。

• 基于測得的分子量數據，能夠清晰地分辨和鑒定 BSA 樣品中存在的不同寡聚狀態（單體、二聚體、三聚體、四聚體）。

• 該技術方案為復雜蛋白質樣品的分子量及聚集行為研究提供了可靠、高效的檢測手段。